El cryo-EM se puede utilizar para determinar las estructuras de grandes complejos moleculares como el complejo de reconocimiento de origen (ORC).El ORC reconoce y une el ADN para iniciar el proceso que copia el material genético de la célula antes de la división celularCrédito: Huilin Li, del Laboratorio Nacional de Brookhaven, y Bruce Stillman, del Laboratorio Cold Spring Harbor.

¿Qué es la cryo-EM, y cómo funciona?

En la cryo-EM, los investigadores congelan rápidamente una célula, un virus, un complejo molecular u otra estructura para que las moléculas de agua no tengan tiempo de formar cristales.Los científicos utilizan un microscopio electrónico para disparar un rayo de electrones a la muestra congeladaEsto crea una proyección bidimensional de la muestra en un detector digital.Al crear cientos de proyecciones de la muestra desde muchos ángulos diferentes y luego tomar el promedio de estos ángulosLos avances recientes en cryo-EM proporcionan imágenes muy detalladas de proteínas y otras estructuras biológicas.incluyendo estructuras más grandes como complejos de ARN-proteína.

Introducción de la microscopía electrónica criogénica (Cryo-EM):

Durante la última década, la microscopía electrónica criogénica (crio-EM) ha reemplazado cada vez más los métodos tradicionales de preparación de muestras para la microscopía electrónica.Fue el trabajo pionero de Taylor y Glaeser y de Dubochet y sus colegas lo que allanó el camino para este desarrollo., que presentó un salto cuántico de la microscopía electrónica biológica, ya que permitió obtener imágenes de muestras completamente hidratadas en un estado cercano al nativo.

El término cryo-EM se refiere a varias modalidades de imágenes microscópicas electrónicas de transmisión cuando se aplican a muestras incrustadas en hielo vítreo.Tres ramas principales de la cryo-EM son relevantes en el contexto de la biología estructural molecularEn el caso de los electrones, el análisis de partículas únicas y la tomografía electrónica.

La cristalografía electrónica ofrece la ventaja de determinar la estructura de las proteínas que forman cristales 2D por debajo de 4Å (por ejemplo, como se muestra con las proteínas de la membrana transportadora de agua - aquaporinas).Las proteínas de membrana son candidatos particularmente prometedores para la formación de cristales 2DSe han obtenido resoluciones superiores a 2 Å. three dimensional electron crystallography of protein microcrystals (microED) has been developed and is showing promises in solving high resolutions structures of proteins forming tiny 3D-crystals (200 nm) usually not amenable for study by x-ray crystallography.

El análisis de partículas únicas se utiliza para ensambles más grandes aislados y purificados de múltiples subunidades que a menudo son muy heterogéneas, metastables y extremadamente difíciles de cristalizar (por ejemplo,el ribosoma o el proteasoma 26S) a una resolución de rutina de 3 ‰ 10 Å y en el mejor de los casos inferior a 2 Å- Rango de tamaño de la muestra: 5-150 nm.

¿Qué es la cristalografía de rayos X y cómo funciona?

La cristalografía de rayos X dispara un haz de rayos X a través de un pequeño cristal sólido compuesto de billones de moléculas de proteínas idénticas.similar a la forma en que las imágenes se capturan en una cámara digitalUna computadora mide la intensidad de los rayos X dispersos para asignar una posición a cada átomo de la molécula cristalizada.Este método se ha utilizado para determinar más del 85 por ciento de las estructuras de las proteínas conocidas.

Algunos detalles sobre la cristalografía de rayos X y la criomecánica:

1Las proteínas pequeñas son más adecuadas para la cristalografía de rayos X, ya que pueden ser difíciles de discernir por cryo-EM.

2La cristalografía de rayos X puede obtener resoluciones muy altas, aunque la criomecánica ha obtenido resultados comparables en los últimos años.

3Las estructuras grandes, complejos y proteínas de membrana pueden ser difíciles de cristalizar.

4La EM (coloración negativa) ofrece una detección rápida de las muestras para descartar la agregación y determinar la oligomerización, dando una visión visual del comportamiento de la muestra y de lo que contiene.

5La cryo-EM requiere cantidades de proteína más bajas que la cristalografía de rayos X. Este método podría beneficiar a las muestras con un rendimiento de menos de 2 mg de proteína (< 5-10 mg/ml).*

El KS-V péptido cryo-EMPlataforma de servicios:

• Selección de la tinción negativa y cálculo de la clasificación 2D
• Preparación de muestras de rejilla congelada y control de la condición
• Recopilación de datos de alta resolución y reconstrucción 3D, modelado