Juntas, estas modificaciones histónicas forman lo que se conoce como el código histónico, que dicta el estado transcripcional de la región genómica local.Examen de las modificaciones de las histonas en una región particular, o en todo el genoma, puede revelar estados de activación génica, ubicaciones de promotores, potenciadores y otros elementos reguladores de genes.

Modificaciones de histona en detalle
 

Acetilación

La acetilación es una de las modificaciones de histonas más estudiadas, ya que fue una de las primeras descubiertas para influir en la regulación transcripcional.Los residuos de lisina no modificados están cargados positivamente, pero la acetilación resulta en la neutralización de la carga en las histonasLa neutralización de la carga resulta en una histona más débil: la interacción del ADN,permite la unión del factor de transcripción y aumenta significativamente la expresión génica (Roth et al.., 2001).

La acetilación de histona está implicada en la regulación del ciclo celular, la proliferación celular y la apoptosis y puede desempeñar un papel vital en la regulación de muchos otros procesos celulares, incluida la diferenciación celular,Replicación y reparación del ADNUn desequilibrio en el equilibrio de la acetilación de histonas está asociado con la tumorigénesis y la progresión del cáncer.

Regulación enzimática

Los grupos acetilo se agregan a los residuos de lisina de las histonas H3 y H4 por histona acetiltransferasas (HAT) y se eliminan por deacetilasas (HDAC).conocido como acetilización localizada por promotorPor ejemplo, la acetilación de K9 y K27 en la histona H3 (H3K9ac y H3K27ac) suele asociarse con potenciadores y promotores de genes activos.También se encuentran bajos niveles de actilación global en todos los genes transcritos, cuya función sigue sin estar clara.

Metilación

La metilación de la arginina promueve la activación transcripcional (Greery otros., 2012) mientras que la metilación de lisina está implicada tanto en la activación transcripcional como en la represión dependiendo del sitio de metilación.Esta flexibilidad puede explicarse por el hecho de que la metilación no altera la carga de histona ni afecta directamente las interacciones histona-ADN., a diferencia de la acetilación.

Las lisinas pueden ser mono-, di- o tri-metiladas, proporcionando una mayor diversidad funcional a cada sitio de metilación.tanto la mono- como la tri-metilación en K4 de la histona H3 (H3K4me1 y H3K4me3) son marcadores de activación, pero con matices únicos: H3K4me1 normalmente marca potenciadores transcripcionales, mientras que H3K4me3 marca promotores de genes.La tri-metilación de K36 (H3K36me3) es un marcador de activación asociado con regiones transcritas en los cuerpos genéticos.

En contraste, la tri-metilación en K9 y K27 de la histona H3 (H3K9me3 y H3K27me3) son señales represivas con funciones únicas:H3K27me3 es una señal temporal en las regiones promotoras que controla los reguladores del desarrollo en las células madre embrionariasMientras tanto, H3K9me3 es una señal permanente para la formación de heterocromatina en regiones cromosómicas pobres en genes con estructuras de repetición tándem, como las repeticiones satelitales,los telómerosTambién marca los retrotransposones y las familias específicas de genes del dedo de zinc (KRAB-ZFP).con H3K27me3 en las regiones codificantes intergénicas y silenciadas y con H3K9me3 predominantemente en las regiones codificantes de los genes activos.

Regulación enzimática

La metilación de histona es una marca estable que se propaga a través de múltiples divisiones celulares, y durante muchos años se pensó que era irreversible.Recientemente se descubrió que es un proceso activamente regulado y reversible.

Metilación: histonas metiltransferasas (HMT)

• Lísina

Contenedor de dominio SET (colas de histona)

Contenedores de dominios no SET (núcleos de histonas)

• Arginina

Familia de las PRMT (proteína arginina metiltransferasas)

Desmetilación: histonas desmetilasas

• Lísina

KDM1/LSD1 (demetilasa específica de lisina 1)

JmjC (que contiene el dominio Jumonji)

• Arginina

PAD4/PADI4

Fósforilación

La fosforilación de histonas es un paso intermedio crítico en la condensación cromosómica durante la división celular, la regulación transcripcional y la reparación de daños en el ADN (Rossetto et al., 2012, Kschonsak et al.,En el año 2015A diferencia de la acetilación y la metilación, la fosforilación de histonas establece interacciones entre otras modificaciones de histonas y sirve como plataforma para las proteínas efectoras.que conduce a una cascada de eventos aguas abajo.

La fosforilación se produce en todas las histonas centrales, con efectos diferenciales en cada una.están involucrados en la compactación de la cromatina y la regulación de la estructura y función de la cromatina durante la mitosisEstos son marcadores importantes del ciclo celular y el crecimiento celular que se conservan en todos los eucariotas.La fosforilación de H2AX en S139 (resultando en γH2AX) sirve como punto de reclutamiento para las proteínas de reparación de daños en el ADN (Lowndes et al.., 2005, Pinto et al., 2010) y es uno de los primeros eventos que ocurren después de las roturas de doble hebra de ADN.La fosforilación de H2B no se ha estudiado tan bien, pero se ha encontrado que facilita la condensación de cromatina relacionada con la apoptosis, fragmentación del ADN y muerte celular (Füllgrabe et al., 2010).

Ubiquitación

Todas las proteínas del núcleo histónico pueden ubiquitalizarse, pero H2A y H2B son las más comunes y son dos de las proteínas más ubiquitatizadas en el núcleo (Cao et al., 2012).La ubiquitilación de histona juega un papel central en la respuesta al daño del ADN.

La monobiquitilización de histonas H2A, H2B y H2AX se encuentra en los sitios de rupturas de doble hebra de ADN. Las formas más comunes son H2A monobiquitilado en K119 y H2B en K123 (levadura) / K120 (vertebrados).El H2A monobiquitilado también está asociado con el silenciamiento de genes., mientras que el H2B también está asociado con la activación de la transcripción.

La poliubiquitación es menos común pero también es importante en la reparación del ADN-- la poliubiquitación de H2A y H2AX en K63 proporciona un sitio de reconocimiento para proteínas de reparación del ADN, como RAP80.

Regulación enzimática

Al igual que otras modificaciones de histonas, la monobicutilación de H2A y H2B es reversible y está estrictamente regulada por las ligasas de histonas ubiquitinas y las enzimas deubiquitizantes.

Monoubiquitación

• H2A: proteínas del grupo policomb
• H2B: Bre1 (levadura) y sus homólogos RNF20/RNF40 (mamíferos)

Polyubiquitación

• Se aplicará el método de ensayo de la prueba de la concentración de H2A/H2AX.
   

Guía de referencia rápida para las modificaciones de histonas

Tabla 1. una hoja de comprobación para las modificaciones de histonas más comunes yDónde encontrarlos:

Estudio de las modificaciones de las histonas por medio de la CHIP

El CHIP utiliza anticuerpos para aislar una proteína o modificación de interés, junto con el ADN al que se une (figura 5).El ADN se secuencia y se asigna al genoma para identificar la ubicación y la abundancia de la proteína o modificación..

Figura 2: Modificación de la histona ChIP

Los anticuerpos se unen directamente a las colas de histonas modificadas. La inmunoprecipitación y la purificación del ADN permiten aislar e identificar las regiones genómicas que ocupan las modificaciones.

El uso de anticuerpos contra histonas específicas y modificaciones de histonas en experimentos de ChIP puede revelar las ubicaciones específicas de

• Estructuras de cromatina de orden superior, por ejemplo H3K9me3 marcas heterocromatina y satélites repite
• Los genes y programas genéticos activos o silenciados, por ejemplo AH3K9ac, marcan la activación de genes
• Elementos genéticos como promotores y potenciadores, por ejemplo H3K27me3 marca promotores en regiones ricas en genes, H3K4me1 marca potenciadores activos

Si se conoce la función de una modificación de histona, ChIP puede identificar genes y regiones específicas con esta firma de modificación de histona y la función correspondiente en todo el genoma.Estos genes y regiones pueden entonces ser examinados más a fondo para su papel en el proceso biológico de interésEl uso de ChIP contra H3K4me1, por ejemplo, revelará las ubicaciones y secuencias de potenciadores activos en todo el genoma, apuntando a genes y programas genéticos de interés.

Alternativamente, si la función de la modificación de la histona no se conoce, el ChIP puede identificar secuencias, genes y ubicaciones con esta firma,que luego se puede utilizar para inferir la función de la modificaciónEsta técnica fue fundamental en la decodificación de gran parte del código histónico y sigue siendo valiosa para determinar la función de modificaciones recientemente descubiertas como la ubiquitilación y otras marcas novedosas.

Enzimas modificadoras de histonas: escritores y borradores
- ¿ Qué?

Las modificaciones histónicas se agregan y eliminan dinámicamente de las proteínas histónicas por enzimas específicas (cuadro 2). El equilibrio entre estos escritores y borradores determina qué marcas están presentes en las histonas,y en qué niveles, para controlar si los programas genéticos específicos y los procesos celulares que orquestan, se encienden o desactivan.

Tabla 2. Las principales categorías de escritores y borradores de histonas:

Identificar las vías de modificación y los escritores y borradores específicos en juego puede revelar:

• Rutas celulares relevantes, programas genéticos y efectos fisiológicos para una mayor investigación.Por ejemplo, las histonas deacetilasas (HDAC) activan las vías de desarrollo inmunológico, mientras que las histonas acetiltransferasas (HAT) desempeñan un papel crucial en la diferenciación y proliferación.
• Desbalances entre escritores y borradores que alteran la programación genética y subyacen a procesos de enfermedades.La caracterización de tales desequilibrios, y las enzimas específicas involucradas, puede proporcionar información sobre la patología de las enfermedades, desde cánceres hasta trastornos autoinmunes.
• Nuevos objetivos farmacológicos y estrategias terapéuticas.Una vez que se identifica un desequilibrio, se pueden desarrollar medicamentos para afectar la actividad de estas enzimas y corregir el desequilibrio,ofreciendo nuevas estrategias terapéuticas contra enfermedades que hasta ahora han eludido los esfuerzos médicosPor ejemplo, muchos inhibidores de HDAC están en desarrollo como nuevos medicamentos contra cánceres y enfermedades inflamatorias como la artritis y la diabetes tipo I.

Para los esfuerzos de desarrollo de fármacos, los compuestos pueden examinarse fácilmente por su impacto en la actividad del escritor y del borrador.

Características de las vías de metilación de histonas

En general, los ensayos de histona metiltransferasa (HMT) son difíciles de desarrollar, y la mayoría tienen varios inconvenientes debido al diseño del ensayo.3H-SAM como donante de metilo y medida S-adenosilhomocisteína (SAH) como un subproducto general de la reacción de metilación.

• Manejo de materiales radiactivos
• Alta sensibilidad para superar k bajo_{el gato}(el volumen de negocios es normalmente < 1 min-1) y K_M.valores para el donante de metilo, SAM
• Purificación previa de complejos enzimático/proteico para evaluar la actividad de HMTs específicos

Los ensayos de actividad HMT de Abcam superan estas dificultades, evaluando la actividad de HMT específicos con anticuerpos que detectan el producto metilado específico, proporcionando:

• Detección fácil por colorimetría o fluorometría, sin radioactividad
• Compatibilidad con extractos nucleares o proteínas purificadas (el ensayo es específico para la modificación de interés)
• Datos en 3 horas

Caracterización de la actividad de la desmetilasa

Los ensayos de actividad de la histona desmetilasa suelen medir la formación de formaldehído, un subproducto de la desmetilación.grupos tiolicos y una gama de ionesAl igual que los ensayos de metilación, estos ensayos no son específicos para ninguna desmetilasa y solo se pueden realizar con proteínas purificadas.

Los ensayos de histona desmetilasa de Abcam® eluden estos problemas midiendo directamente la formación del producto desmetilado, proporcionando:

• Aumento de la sensibilidad (20-1.000 veces) en comparación con los ensayos basados en formaldehído
• Datos más precisos sin interferencia de tiolos, detergentes o iones
• Compatibilidad con extractos nucleares o proteínas purificadas (debido a la especificidad del ensayo para la modificación de interés)
• Mide la actividad de la desmetilasa de una amplia gama de especies, incluidas las células/tejidos de mamíferos, plantas y bacterias
• Formato rápido de microplacas con lecturas colorimétricas o fluorométricas simples
• Datos en 3 horas

Características de las vías de acetilación de histonas

Abcam ofrece kits para analizar la actividad de HAT en general, así como H4-específica.que genera el péptido acetilado y CoA-SHEl subproducto CoA-SH se mide a continuación mediante métodos colorimétricos o fluorométricos:

• Ensayos colorimétricos- CoA-SH sirve como una coenzima esencial para producir NADH, que reacciona con un tinte tetrazolio soluble para generar un producto que se puede detectar espectrofotométricamente.Este ensayo es ideal para estudios cinéticos, con detección continua.
• Ensayos fluorométricos- CoA-SH reacciona con un desarrollador y la sonda para generar un producto que se detecta fluorométricamente.

Característica de la actividad de la histona desacetilasa

Las proteínas HDAC se dividen en cuatro grupos principales (clase I, clase IIA, clase IIB, clase III, clase IV) en función de la función y la similitud de la secuencia de ADN.y IIB se consideran HDAC "clásicos" cuyas actividades son inhibidas por la tricoestatina A (TSA), mientras que la clase III es una familia de NAD+La clase IV se considera una clase atípica en sí misma, basada únicamente en la similitud de la secuencia de ADN con las demás.

Cada una de estas clases está asociada con diferentes programas celulares y puede analizarse individualmente con varios ensayos fluorométricos.Las SIRT se asocian típicamente con cánceres y enfermedades neurológicasLa detección de la actividad de SIRT, o la identificación de medicamentos que afectan a la actividad de SIRT, pueden indicar nuevos diagnósticos o estrategias terapéuticas para estas enfermedades.

Los ensayos fluorométricos utilizan un sustrato de péptido acetilado con un fluoróforo y un quencher en sus terminales amino y carboxilo.liberación del fluoróforo del extintorEl posterior aumento de la intensidad de fluorescencia del fluoróforo es directamente proporcional a la actividad de la deacetilasa.

Inhibición de escritores y borradores

Puede ser útil inhibir estas enzimas modificadoras utilizando pequeñas moléculas y luego evaluar las consecuencias aguas abajo para investigar la participación y las funciones biológicas de las modificaciones de histonas.Los inhibidores de los escritores y borradores son herramientas vitales para entender el papel de las vías de modificación epigenéticaTambién son esenciales para la validación de objetivos "drugables" en el contexto de estudios preclínicos, tanto en el contexto académico como en el de la industria.

Lectores/traductores de modificación de histonas

Las modificaciones de histona regulan las propiedades físicas de la cromatina y su estado transcripcional correspondiente,Ya sea directamente (por ejemplo, grupos acetil que repelen el ADN cargado negativamente para crear una conformación de cromatina abierta) o a través de adaptadores de proteínas llamados efectoresLas proteínas efectoras reconocen y se unen a marcas epigenéticas específicas, y posteriormente, reclutan maquinaria molecular para alterar la estructura de la cromatina.Estos lectores epigenéticos determinan el resultado funcional de las modificaciones de las histonas traduciendo el código de las histonas en acción.

Los dominios efectores reconocen modificaciones específicas de histona

Las proteínas efectoras reconocen y se unen a las marcas de modificación de histonas a través de dominios efectores, conocidos como módulos (cuadro 3).

Estos módulos reconocen modificaciones específicas de las histonas con aminoácidos que recubren la bolsa de unión del módulo.los residuos situados fuera de esta bolsa de unión (especialmente en las posiciones N+2 y N-2) dictan la especificidad del residuo de histona y aminoácidos que se modifica (por ejemplo, H3K4 vs H4K20).

Las pequeñas variaciones en los residuos dentro o fuera de la bolsa de unión permiten reconocer marcas epigenéticas similares.o estados de tri-metilación con ligeras variaciones en la estructura del módulo de unión al metiloPor ejemplo, los dominios de Tudor pueden unirse exclusivamente a lisinas di- o tri-metiladas, mientras que los módulos de dedos PHD pueden unirse a ambas, o sólo a lisinas no modificadas (Ruthenburg et al., 2007).

La multivalencia permite la complejidad del código histónico

A menudo se encuentran múltiples módulos de unión histónica en la misma proteína y/o complejo proteico, que permiten reconocer combinaciones específicas de modificaciones histónicas.Esto permite un código histónico más complejo, donde las modificaciones histónicas interactúan entre sí en lugar de ser interpretadas de forma aislada.

La interacción multivalente de las modificaciones histónicas es importante para reconocer patrones de marcado discretos con especificidad compuesta y afinidad mejorada.Al mismo tiempo que permite acciones diversas y precisas en el sentido descendentePor ejemplo, una sola marca epigenética (como H3K4me3) puede activar la transcripción génica en un contexto, pero reprimirla en otro, dependiendo de las marcas circundantes.La tabla 4 muestra ejemplos de algunas de las asociaciones funcionales de diferentes combinaciones de modificaciones histonales (Ruthenburg et al.., 2007).

Tabla 4. Asociaciones funcionales de las modificaciones de histona y ADN coexistentes:

Múltiples módulos efectores en una proteína o complejo pueden interactuar con modificaciones de histona en la misma, o a través de, histonas y/o nucleosomas.

Intranucleosomal:que se une al mismo nucleosoma

• Cis-histona: se une a la misma cola de histona
• Transhistona: se une a las diferentes colas de histona

Internucleosomal:Se une a diferentes nucleosomas

• Puente adyacente: unión a los nucleosomas adyacentes
• Puente discontinuo: unión a los nucleosomas no adyacentes

Las referencias

Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T.Y., Schones, D.E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., y Zhao, K. Perfil de alta resolución de las metilaciones de histonas en el genoma humano.823 a 837 (2007).

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Füllgrabe, J., Hajji, N. & Joseph, B. Descifrando el código de la muerte: modificaciones de histonas relacionadas con la apoptosis.

Greer, E. L. & Shi, Y. Metilación de histona: una marca dinámica en la salud, la enfermedad y la herencia.

Kim, J. y Kim, H. Recrutamiento y consecuencias biológicas de la modificación de histonas de H3K27me3 y H3K9me3.

Kschonsak, M. & Haering, C. H. Formar cromosomas mitóticos: desde conceptos clásicos hasta mecanismos moleculares.

Lowndes, N. F. & Toh, G. W.-L. Reparación del ADN: la importancia de la fosforilación de la histona H2AX.

Pinto, D. M. S. & Flaus, A. Estructura y función de la histona H2AX. Subcélula. Bioquímica. 50, 55 ̊78 (2010).

Rossetto, D., Avvakumov, N. y Côté, J. Fosforilación de histona: Una modificación de la cromatina involucrada en diversos eventos nucleares.

Roth, S. Y., Denu, J. M. y Allis, C. D. Histona acetiltransferasas. Anual Rev. Biochem. 70, 81 ¢ 120 (2001)

Ruthenburg, A.J., Li, H., Taverna, S.D., Patel, D.J. y Allis, C.D. Engaño multivalente de las modificaciones de la cromatina por módulos de unión vinculados.

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